О.В. БУДИЛОВСКАЯ, К.В. СТОРОЖЕВА, А.А. КРЫСАНОВА, К.В. ШАЛЕПО, К.В. ОБЪЕДКОВА, В.В. ХАЛЕНКО, Ю.Р. РЫЖОВ, Т.А. ХУСНУТДИНОВА, Н.И. ТАПИЛЬСКАЯ, А.М. САВИЧЕВА

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта» Минобрнауки России,
Санкт-Петербург, Россия

РЕЗЮМЕ

Анализ причины повторных неудач имплантации в настоящее время находится на этапе накопления научных знаний. Иммуномодуляция эндометрия после внутриматочной инсеминации активированными аутологичными мононуклеарными клетками периферической крови может быть перспективным терапевтическим решением.

Цель исследования. Определить локальный цитокиновый профиль эндометрия у пациенток с многократными неудачными попытками вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) и эффективность его коррекции раствором лиофилизата секретома мононуклеаров периферической крови путем внутриматочной перфузии.

Материал и методы. В исследование включены 55 пациенток в возрасте от 29 до 47 лет с наличием в анамнезе бесплодия более 5 лет и многократными неудачами ВРТ. Пациентки распределены в 2 группы. Основную группу составили женщины, у которых наступила беременность, группу сравнения — женщины, у которых беременность в результате лечения не наступила. После лечения у 14 пациенток повторно выполнен анализ локального цитокинового профиля эндометрия. Исследование микробиоты эндометрия и определение генов маркеров локального иммунного ответа проводили с помощью молекулярно-биологических тестов.

Результаты. При анализе соотношений экспрессии генов врожденного иммунитета установлены статистически значимые различия между показателями IL-18 и профилем IL-10/IL-18. Уровень IL-18 после лечения стал существенно выше по сравнению с показателем до лечения, что составило 3,8 [3,47; 4,07] и 3,3 [2,747; 3,5] соответственно, p<0,05. Соотношение IL-10/IL-18 до лечения составило 26,45 [21,64; 160,54], что было выше по сравнению с показателем после лечения — 16,7 [10,45; 50,77], p<0,05.

Выводы. После комплексной терапии лиофилизатом секретома мононуклеаров периферической крови (препарат Суперлимф) достигнуто улучшение иммунологических показателей эндометрия, увеличивающих вероятность успешной имплантации. Внутриматочное введение секретома мононуклеаров периферической крови потенциально показало себя как хороший способ модуляции восприимчивости эндометрия.

ВВЕДЕНИЕ

В программах вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) у 60—70% женщин после переноса эуплоидного эмбриона хорошего качества беременность не наступает¹. Репродуктивные неудачи могут быть связаны с материнскими и отцовскими факторами, качеством гамет и эмбрионов, особенностями образа жизни в сочетании с психологическим состоянием. Одной из вероятных причин, препятствующих имплантации, является дисбиоз полости матки².

Исследование микробиоты эндометрия в контексте бесплодия привлекает все больше внимания с позиций потенциальных возможностей терапии. Определение различных медиаторов воспаления в тканях и биологических жидкостях лежит в основе перспективного направления для диагностики локального воспаления³. Аномальная активация врожденного иммунитета эндометрия, стимулируемая различными патогенами, может представлять собой один из механизмов, в настоящее время недостаточно изученных, отрицательно влияющих на рецептивность эндометрия⁴. Имеются данные, позволяющие предположить, что цитокины, продуцируемые материнским эндометрием и развивающимся эмбрионом, играют основополагающую роль в этом процессе. Ряд исследователей отводят особую роль в успехе имплантации локальной иммунной толерантности, включающей в себя большое количество механизмов, в том числе продукцию цитокинов, интерлейкинов и факторов роста^5,6. Описаны изменения некоторых иммунных клеток, таких как нейтрофилы, макрофаги, NKклетки и T- и B-клетки, тесно связанные с развитием эндометриоза, и как следствие реакция интерлейкинов и сдвиги экспрессии их рецепторов, что отражается на секреторных функциях эндометрия, ассоциированных с субфертильностью и бесплодием⁷.

Субклиническое воспаление в тканях эндометрия протекает, как правило, локально, что определяет сложность выявления патогенетических факторов, низкую информативность и чувствительность традиционных методов лабораторной диагностики — исследования системного цитокинового профиля. Определение уровня специфических цитокинов и интерлейкинов может рассматриваться в качестве прогностических биомаркеров имплантации перед переносом эмбриона⁸. В преодолении инфекционного фактора в генезе имплантационных неудач современная терапия, направленная на элиминацию патогенов, далеко не всегда приводит к желаемому результату, и это означает необходимость новых подходов. Неудачи имплантации, вызванные иммунологическими факторами, можно контролировать с помощью инновационных методов лечения. Среди них внутриматочное введение аутологичных мононуклеарных клеток периферической крови⁹. Таким образом, иммуномодуляция эндометрия представляется как инновационный метод лечения для предотвращения повторных неудач имплантации при ВРТ.

Цель исследования — определить локальный цитокиновый профиль эндометрия у пациенток с многократными неудачными попытками ВРТ и эффективность его коррекции раствором лиофилизата секретома мононуклеаров периферической крови путем внутриматочной перфузии.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Дизайн исследования. С мая 2022 по сентябрь 2024 г. включительно проведено проспективное наблюдательное исследование по оценке локального цитокинового профиля до и после внутриматочного введения лиофилизата секретома мононуклеаров периферической крови в лечении пациенток с повторными неудачами имплантации в протоколах ВРТ. В исследование включено 55 пациенток в возрасте от 29 до 47 лет с наличием бесплодия в анамнезе более 5 лет и многократными неудачами ВРТ. Пациентки распределены в 2 группы. Основную группу составили женщины, у которых наступила беременность (беременность «+»), группу сравнения — женщины, у которых беременность в результате лечения не наступила (беременность «–»). После лечения у 14 человек повторно определен локальный цитокиновый профиль эндометрия.

Способ введения исследуемого препарата. Все женщины получали 10 внутриматочных введений лиофилизата секретома мононуклеаров периферической крови 1 раз в 3—5 дней за исключением периода менструации, в течение которого препарат не вводили. Перед введением разводили 2 официнальных флакона лиофилизата секретома мононуклеаров периферической крови (препарат Суперлимф) в дозе 200 мг в 1,0 мл воды для инъекций или в 1,0 мл физиологического раствора. Введение изготовленного раствора выполняли с помощью тонкого внутриматочного атравматичного катетера.

Критерии эффективности. Критериями эффективности проводимой терапии было наступление беременности в протоколе ВРТ или в протоколе переноса размороженных эмбрионов, а также наличие спонтанной беременности, зарегистрированной в течение 3—6 месяцев после прекращения введения исследуемого препарата в полость матки.

Описание исследования. До начала терапии у всех пациенток на 19—21-й день менструального цикла во время проведения гинекологического осмотра выполняли забор эндометрия с помощью атравматичного зонда. Часть полученного материала, предназначенного для оценки микробиоценоза с обнаружением возбудителей инфекций, передаваемых половым путем, и вирусов, помещали в транспортную среду с муколитиком (ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора, Россия). Другую часть биоматериала, необходимого для оценки профиля экспрессии мРНК генов иммунного ответа с применением теста ИммуноКвантэкс во избежание деградации РНК помещали в среду для стабилизации РНК в биопробах (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия).

Для выделения ДНК из материала использовали комплект реагентов «ДНК-сорб-АМ» (ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора, Россия). Для определения мРНК генов врожденного иммунитета проводили выделение нуклеиновых кислот с использованием набора «Проба-НК» (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия) с дальнейшим проведением реакции обратной транскрипции. Для постановки реакции использовали детектирующие амплификаторы DTprime 5 (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия).

Молекулярно-биологическое исследование микробиоты полости матки проводили с использованием тестов Фемофлор-16, ГерпесКомлекс, Квант 21, ХЛАМИ-ГЕН, ГОНО-ГЕН, EBV и HHV6 (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия). С помощью теста Фемофлор-16 определяли тотальную концентрацию бактериальной ДНК и концентрацию (абсолютную и относительную) следующих видов/родов микроорганизмов: Lactobacilluss pp., семейство Enterobacteriaceae, Streptococcus spp., Staphylococcus spp., Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia/Porphyromonas spp., Eubacterium spp., Sneathia spp./Leptotrichia spp./Fusobacterium spp., Megasphaera spp./Veillonella spp./Dialister spp., Lachnobacterium spp./Clostridium spp., Mobiluncus spp./Corynebacterium spp., Peptostreptococcus spp., Atopobium vaginae. Кроме того, оценивали абсолютную концентрацию Mycoplasma hominis, Ureaplasma spp., Candida spp. и наличие/отсутствие Mycoplasma genitalium. Используя наборы реагентов ХЛАМИ-ГЕН, ГОНО-ГЕН, EBV и HHV6, определяли патогенные микроорганизмы (Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae) и репродуктивно-значимые вирусы: вирус герпеса человека 6-го типа (HHV-6A), вирус Эпштейна—Барр (EBV). Используя мультиплексный тест «ГерпесКомплекс», определяли вирусы цитомегалии (CMV) и простого герпеса 1-го и 2-го типа (HSV1/2). Тест-система Квант 21 позволяла идентифицировать ВПЧ высокого (16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73, 82-й типы) и низкого (6, 11, 44-й типы) онкогенного риска.

Исследование уровней экспрессии мРНК генов врожденного иммунитета (IL-1B, IL-10, IL-18, TNF-α, TLR4, GATA3, CD68, B2M) с проведением объективной диагностики воспалительного процесса выполняли с помощью тест-системы ИммуноКвантэкс, позволяющей интегрально оценить уровень мРНК цитокинов и получить заключение о наличии локальной воспалительной реакции на основании автоматического расчета Индекса воспаления.

Статистический анализ. Проведено описание групп, а также сравнение частотных признаков между подгруппами по исходу беременности, выполнен анализ данных двух зависимых выборок до и после лечения. Качественные признаки представлены в виде абсолютных (количество) и относительных (доля/ частота, в %) данных, количественные — в зависимости от варианта распределения признака в виде среднего значения и среднеквадратичного отклонения μ±SD (нормальное распределение) или в виде медианы с границами 25% и 75%-го перцентиля (отличное от нормального распределение). С учетом небольшой выборки вариант распределения признака в группе определяли критерии Андерсона—Дарлинга, Шапиро—Уилка. Значимость различий в подгруппах в зависимости от наступления беременности проверяли с учетом варианта распределения данных с использованием t-теста Стьюдента или U-критерия Манна—Уитни соответственно. Соотношение частот качественных признаков в подгруппах сравнивали с помощью теста хи-квадрат (χ2) Пирсона. Сравнение двух зависимых выборок проведено с использованием критерия t-Стьюдента и критерия Вилкоксона в зависимости от варианта распределения. Критический уровень достоверности нулевой статистической гипотезы (об отсутствии значимых различий или факторных влияний) принимали равным 0,05.

Этические правила и нормы. Исследование выполнено в полном соответствии с принципами Хельсинкской декларации Всемирной ассоциации «Этические принципы научных и медицинских исследований с участием человека», действующими порядками и стандартами оказания медицинской помощи, а также другими регуляторными требованиями к проведению клинических исследований и наблюдательных программ в Российской Федерации. При соотношении пользы и рисков от режима внутриматочного введения исследуемого препарата учитывалась совокупная польза для участниц исследования с длительным бесплодием, заключающаяся в комплексной диагностике микробиоты полости матки, расчете индекса воспаления высокоинформативными методами, а также в ранее продемонстрированной эффективности внутриматочных инфузий лиофилизатом секретома мононуклеаров периферической крови в контексте наступления клинической беременности у пациенток с бесплодием и повторными неудачами имплантации.

Ознакомиться с материалом можно по ссылке: О.В.БУДИЛОВСКАЯ, К.В. СТОРОЖЕВА, А.А. КРЫСАНОВА, К.В. ШАЛЕПО, К.В. ОБЪЕДКОВА, В.В. ХАЛЕНКО, Ю.Р. РЫЖОВ, Т.А. ХУСНУТДИНОВА, Н.И. ТАПИЛЬСКАЯ, А.М. САВИЧЕВ «Локальный цитокиновый профиль эндометрия у пациенток с повторными неудачами имплантации и его фармакологическая коррекция секретомом мононуклеаров периферической крови», ж-л «Проблемы репродукции» 2024, Т. 30, №5, с. 46–54